2009 年，已成为生化危机安全评估联盟（Bioterrorism Security Assessment Alliance，简称 BSAA）成员的克里斯·雷德菲尔被部署到非洲小镇吉鸠就（Kijuju），与席娃·亚洛玛合作逮捕试图在黑市出售生化的里卡德·亚文（Ricardo Irving）。当地被强迫喂食寄生体的迅速变成马吉尼（Majini）并多次向二人作出攻击。在前往亚文交易地点时，克里斯和席娃发现 Alpha 队伍被不明生命体杀死，在场奄奄一息的队长迪恰恩特（Dechant）在死前交出了一个装有亚文资料的硬盘。二人在消灭了该不明生命体后把硬盘内的资料传回本部并奉命继续追捕亚文。因此两人的正式任务就此展开。
游戏设定
《生化危机 5》的画面结构与《生化危机 4》相同，男主角克里斯在举枪的状态下会在画面的左方，而女主角席娃举枪时的状态会在画面的右方，这次加入线上和线下的两人合作的模式，而且可以透过互联网下载追加的游戏内容。
合作模式（Co-op Mode）
本作包含 2 人合作游玩主篇的模式，此模式分为连线及离线两种，离线时主机需要两个***，而画面则会上下分割显示。
对战模式（Versus）
此为付费的追加下载内容，玩家可以组成最多 4 人的连线对战游戏，此模式细分为两种，分别是「SLAYERS」和「SURVIVORS」。SLAYERS 是以敌人「马吉尼（Majini）」为目标而获取分数的模式，SURVIVORS 则是以其他玩家作目标而获取分数。SLAYERS 和 SURVIVORS 都可以选择个人战或团队战（例如 2 对 2，PC 版则没有）。
佣兵模式（The Mercenaries）
本作保留了《生化危机 3》开始出现的佣兵模式。与 3 代不同的是，玩家操作不同的角色挑战关卡，在限制时间内杀死盡可能多的敌人，以追求高分为目的。所得分数可用于开启游戏内的一些隐藏要素，此模式共八个关卡，获得一定分数后会自动开启新关卡。另外，亦可以透过互联网下载 THE MERCENARIES DUO 模式，通过该模式 2 位玩家可以在线协力挑战佣兵模式。
游戏特色
光源
曾经说明《生化危机 5》的阳光及灯光效果将会实现对眼睛有一定的影响，例如由光明的地方进入黑暗的地方，主角的眼睛会先看不清楚内里的环境，待眼睛适应之后才会慢慢看得清楚。相反，走出阳光猛烈的地方时，主角的双眼感到耀眼便会有瞬间是雪白，看不到周围的环境。
集体疯狂
《生化危机 5》的敌人不再是僵尸而是马吉尼（Majini）。他们的智力非常高，将会以「集体疯狂」的方式去攻击主角，比起前作更懂得利用***。他们是寄生了 Plagas Types 2&3，还有些感染了衔尾蛇病毒（Uroboros）。
神秘女角
《生化危机 5》在 E3 电玩展展示的最新片段出现了一个神秘女角，身穿黑色斗篷，带上一个鸟形面具，外国玩家称她为 Birdlady。由执行制作人竹内润的口中得知她将会是本集游戏的关键人物。而这个女角就是《生化危机》和《生化危机 3》的女主角吉儿·范伦廷。
系统 《生化危机 5》取消了《生化危机 4》的商人系统，改以在关卡开始前或是死亡重来时，可整理物品道具及购买升级机制。并且本作的也比前作多很多。卡普空将前作《生化危机 4》中的无限子弹 Thompson 改为无限子弹系统，只要将***升级至最大性能，即可用通关分数换取无限子弹功能。
游戏说明
需要关闭SIP。